1. 基因编辑治疗策略
目前已经有几种体内基因编辑疗法，包括核酸酶（当然就有CRISPR-Cas）、Base Editor和Prime Editor等，具体都恰好可以参考本号此前的综述回顾文章《叩响CRISPR基因编辑治疗之门》。
2. 体内递送载体的必要特征
基因编辑工具可以编码的DNA或mRNA形式、或直接作为蛋白质或核糖核蛋白（RNP）递送到细胞中，各路径都需要克服几大分子生物学的障碍：
A）将搭载物封装于蛋白质或脂质构成的外壳中，保护其在进入细胞前不受螯合或降解等破坏，还须避免被免疫系统识别、否则也会被降解，此外一些载体组成成分易于激活补体系统或抗体介导的免疫识别、会导致巨噬细胞的免疫清除。
B）递送载体需要能够靶向结合到目标细胞，这与给药方式有关，静脉注射可以有效进入如肝脏等组织，但一些诸如血脑屏障等固有生物屏障使得进入中枢神经系统等较为困难，因而需要采用局部注射；然而，物理上的给药位置并不必然带来有效的递送，递送载体必须能够利用其表面的部分元件与靶细胞表面受体形成互补结合，从而促进进入细胞。
C）递送载体必须能够穿过细胞膜进入胞内，通常在与靶细胞表面受体结合都会促进细胞内吞作用。
D）往往载体和搭载物会在内涵体被降解，因而需要载体能够实现内涵体逃逸，将搭载物释放到细胞质中将搭载物释放到目标的胞内区域。
在过去几十年中，确定了几种满足以上标准、从而有望克服这些细胞内递送障碍的载体类型，包括病毒载体、脂质纳米粒（LNP）和病毒样颗粒（VLP）等。
3. 病毒载体
病毒在自然进化过程中不断克服体内递送的障碍，从而天然具备可以将核酸递送进入多种细胞的能力，因此病毒载体成为基因治疗领域较为热门的载体，已经有多种病毒载体被开发用于体内基因治疗、相关临床试验超过1,000项，其中大多数采用腺相关病毒（AAV）、少数采用慢病毒或腺病毒。值得注意的是，已经有一项治疗遗传性失明的临床试验，采用AAV将基因编辑药物递送至眼睛。
3.1 AAV载体
AAV是一种约25nm的无包膜病毒，由60个拷贝的病毒蛋白VP1、VP2、VP3组装成正二十面体衣壳。AAV能包装约5kb的单链DNA，已被应用于递送很多获批和正在临床开发的基因疗法，是目前最流行的用于递送DNA的病毒载体。
AAV载体有诸多优势，安全性较好，生物相容性高，能有效递送至多种组织器官，包括眼、肝、脑、心肌和骨骼肌等，而不同的天然存在的AAV衣壳血清型能用于转染不同的组织，给研究者提供不同的靶向性。实验室定向进化和理性设计改造，能够进一步扩展AAV衣壳的组织靶向性，但目前还很少有通过这种改造的AAV进入临床。
使用AAV载体时，核酸片段大小是一个重要的考量因素，因为其包装容量仅为5kb，而且两段必须有两个反向末端重复序列（ITR），使得真正可用的转基因区间只剩下4.7kb左右。这种容量限制了AAV用于搭载基因编辑的潜力，因为多数使用SpCas9的base editor和prime editor都很难用一个AAV装下。除了DNA编码序列和gRNA，AAV载体还需要包装启动子和顺式调控元件等，这些额外成分都进一步限制了搭载能力。
3.2 双AAV递送策略
为了解决AAV包装限制的问题，研究者正在试图讲基因编辑元件拆成两半，分别装入两个AAV载体，给药到体内后在同时被两种AAV转染的细胞中，在DNA、pre-mRNA或蛋白层面，重构出完整的基因编辑系统。mRNA和蛋白质的反式剪接策略，都被用于重构两个分拆包装的基因编辑元件，以蛋白质反式剪接为例，将分拆的基因编辑元件每一半与内含肽融合，然后用AAV包装转染到细胞内后，两段蛋白被表达出来，内含肽的二聚化促使部分或全部的反式蛋白剪接，从而重新拼出完整的基因编辑器。
目前内含肽介导的蛋白质反式剪接策略，比mRNA的反式剪接策略平均效率高4.5倍，可能是因为mRNA的反式剪接涉及AAV基因组环化与ITR序列的转录和剪接两步，这可能会破坏pre-mRNA的稳定性。因而蛋白质反式剪接策略被认为是实现双AAV递送更简单稳健的方法。
已经有多项研究使用了内含肽介导的双AAV策略，在不同器官中实现了9-60%的编辑效率。例如，使用双AAV9搭载靶向PCSK9的ABE编辑器，在小鼠体内实现60%的编辑效率，血清中PCSK9蛋白降低了6.8倍、血清当初降低了3.3倍；而Prime Editor比Base Editor还要大约1kb，也有研究报道使用双AAV8载体搭载靶向DNMT1的Prime Editor编辑器，实现了14%的编辑效率。
3.3 单AAV递送更小的Cas同源物
虽然双AAV策略已经有了部分应用，但毕竟在生产和表征上比单AAV仍有不可回避的劣势，而且在基因编辑疗法中也会需要更高的剂量，转染效率也势必受到影响。
通过寻找比Cas9更小的直系同源蛋白或工程化改造出更小的Cas9变体，则可以实现仍使用单AAV递送的基因编辑策略。例如，仅有3.16kb的SaCas9，就可以被单AAV搭载，顺便还能装下1-2个sgRNA；还有各类较小的Cas9变体，包括Nme2Cas9（3.24kb）、CjCas9（2.95kb）、SauriCas9（3.18kb）等，都拓宽了单AAV递送的范围。
3.4 减少AAV递送的基因编辑系统的长期表达
AAV递送方法的突出局限性之一是转染后的持续表达，因为AAV基因组会在细胞核中长期保持游离状态，可能持续表达多年，这对于基因编辑疗法来说有可能大大增加脱靶的风险，而且长期表达Cas9这种非人源的蛋白也会引发免疫系统对表达Cas9的细胞进行清除。为了解决这一问题，多种瞬时表达的AAV递送基因编辑系统正在进行研究。
一个比较值得注意的策略，是利用小分子控制的RNA剪切来精准调控AAV表达，有小分子药物的情况下mRNA会包含带有起始密码子的外显子、从而能够完整表达，缺少小分子药物的情况下mRNA则不会包含该外显子、从而使得蛋白无法表达。
除了在时间上调节AAV载体的表达策略以外，还有在空间上调节的方法，通过使用组织特异性的AAV衣壳、启动子或miRNA，使得其搭载的基因编辑器只在特定组织内表达，从而最大限度减少其他组织内的脱靶编辑。然而，天然或改造的AAV衣壳虽然有组织特异性、却不一定在不同组织之间有足够高的选择性，AAV包装尺寸问题会对使用组织特异性启动子造成限制。有一种策略是将内源性miRNA的结合位点整合到Cas9表达片段的3' UTR，这样在miRNA水平高的组织中Cas9蛋白表达会被沉默，而在miRNA水平低的组织中能够表达。
总的来说，在空间和时间上调控AAV递送的基因编辑器的表达，能够最大化其编辑的特异性，从而提高治疗的安全性。
3.5 慢病毒载体
慢病毒（LV）是一种来源于HIV-1的包膜病毒，通过3' LTR缺失和拆分病毒生产所需原件来使其无法自我复制。LV可以递送RNA，通过逆转录后半随机地整合到转染细胞基因组中；也有被改造的IDLV，其整合酶结构域失活，从而病毒cDNA在逆转录后仍保持游离状态。LV主要用于体外基因递送，特别会对造血干细胞和T细胞，已有多种通过LV转染的CAR-T疗法获批。
LV有多种对基因编辑较为有利的优势：首先是它可以搭载高达10kb的片段，足以将已知所有的基因编辑元件包装进单个载体，这也非常适合递送基于CRISPR且需要多个sgRNA的多重编辑系统；其次，LV可以有效转染分裂期和非分裂期的细胞；再次，IDLV基因组也可以作为HDR模板；最后，可以通过改变病毒粒子的包膜糖蛋白来调控LV的亲嗜性。
LV用于体内基因编辑的案例还较少，其显著缺点就是会整合进基因组，尽管改造IDLV目的是非整合性的，但仍存在一定的整合可能性，并且也存在基因编辑器长期表达而导致脱靶风险升高的问题。事实上，体内通过LV转染的基因疗法在临床应用中，的确带来遗传毒性、免疫原性以及高生产成本等诸多问题，限制了LV载体在体内基因编辑的应用。
3.6 腺病毒载体
腺病毒（Ad）是一种二十面体的无包膜病毒，约90-100nm，拥有较大的基因组（约36kb），可以递送DNA片段，在转染细胞核中保持游离状态。Ad是目前基因治疗临床试验中最常用的病毒载体（占比>20%），主要因为它具有超大的包装容量、明确的生物学特性、基因稳定性、高转染效率以及适合高滴度大规模生产，此外有57种已知的Ad血清型可以转染人类和约100种可以转染灵长类动物，让研究者可以通过使用不同衣壳来调整亲嗜性。
已有Ad应用于人体内编辑的研究，例如使用Ad将ABE递送至HSC，破坏胎儿血红蛋白启动子中的阻遏蛋白结合位点，用于治疗镰状细胞病和β地贫。该策略使用两个Ad，一个递送Base Editor和选择性标记MGMTp140k（两侧有用于基因组整合的ITR），另一个递送将选择性标记整合进转染细胞基因组所需的转座酶和重组酶。在治疗16周后，HSPC中目标位点有20%被编辑，使得胎儿血红蛋白正常表达。
虽然Ad递送基因编辑器能够在体内有效编辑，但也导致产生对Cas9的中和抗体，可能是由于载体的免疫原性。因此，将Ad用于体内基因编辑的缺点包括免疫原性且易引起T细胞介导的细胞毒性等，通过尽可能减少病毒抗原表达可降低免疫原性。腺病毒在新冠肺炎疫苗中的应用带来了更多关注，但在体内基因编辑递送方面的更广泛应用仍有距离。
3.7 病毒载体递送体内基因编辑的未来
总体上，病毒载体在递送体内基因编辑方面展现出巨大的前景，提供了较高的基因编辑效率，未来仍需要对病毒载体持续改进以克服多项挑战，包括免疫原性、长期表达问题、脱靶编辑、基因组整合风险、生产成本和剂量限制性毒性等。通过工程化改造来提高活性和组织特异性，可以有效降低剂量和制造成本。靶向编辑后沉默基因的持续表达，也可以显著改善安全性。
如下所述，通过将病毒载体的高效率和非病毒载体的瞬时表达特性相结合，有可能产生混合的最佳策略。
4. 脂质纳米粒载体
几十年来，脂质纳米粒（LNP）一直作为核酸药物的递送载体，包括siRNA和mRNA等。LNP包裹搭载物后，首先通过内吞作用进入细胞，通过酸化破坏内涵体膜进入细胞质。LNP完全由化学合成，通常由四种成分组成：阳离子或可电离脂质体、辅助脂质体、聚乙二醇（PEG）脂质体和胆固醇，改变这些成分可以产生具有不同性质的LNP，包括不同的PK特性和靶向不同的细胞类型。
FDA已批准LNP递送的静脉注射治疗性siRNA和肌肉注射mRNA疫苗，且LNP也正在用于向肝脏递送Cas9 mRNA的临床试验，有望成为许多体内基因编辑应用的选择。
4.1 LNP用于肝脏递送
大多数静脉注射的纳米颗粒会在肝脏富集，具体到LNP会在血中被ApoE脂蛋白包裹，通过ApoE:LDL受体介导的相互作用被肝细胞所摄取，因而LNP最常见的应用就是将治疗药物递送至肝脏。
虽然最初LNP是针对递送siRNA进行设计优化，但最重要的进展是成功地封装和递送了mRNA。目前已经有研究，将用于mRNA递送的LNP配方进行优化，来尝试将表达SpCas9核酸酶的mRNA递送至肝脏，这种mRNA以假尿苷和5'-甲基胞苷修饰来提高稳定性和降低免疫原性。最初LNP只是递送SpCas9 mRNA，而sgRNA和HDR供体DNA模板是由AAV8载体递送，在小鼠肝脏中能对酪氨酸败血症突变带来24%的indels和0.8%的修正，足以达到通过编辑替换肝细胞来治愈疾病的目的；后来，将sgRNA以2’-OMe、2’-F和硫代磷酸酯修饰后再封装在LNP中，可实现更强的基因编辑效率，在小鼠模型中静脉注射同时封装SpCas9 mRNA和经化学修饰的靶向PCSK9的sgRNA，基因编辑效率高达80%以上，血清PCSK9降低到检测不到的水平以下。
在一项正在进行的I期临床试验中，已经在6例遗传性TTR蛋白淀粉样变性患者中证明LNP递送mRNA策略能有效实现肝脏基因编辑，在0.1和0.3mg/kg剂量下，血清TTR水平分别下降了53%和87%。
除了递送Cas9核酸酶的mRNA，LNP还被用于递送Base Editor的mRNA，目前有研究将ABE mRNA、SaCas9-BE3 mRNA等递送至小鼠和食蟹猴等，实现10%以上的编辑效率，表明使用LNP进行肝靶向递送碱基编辑器的策略有一定前景。
4.2 LNP用于非肝脏递送
由于大多数静脉注射的LNP会在肝脏中富集，靶向非肝脏的LNP递送基因编辑具有一定的挑战性。一种可能的方式是通过局部注射，例如有过研究，局部注射脂质包裹的RNP后，在小鼠内耳和视网膜中实现核酸酶编辑和碱基编辑；但毕竟局部给药的应用范围还是太窄，开发能全身给药的LNP载体来实现非肝脏递送，才能大大拓展应用范围。
一种方法是在体内同时大量筛选LNP，使用独特的DNA条码标记不同的LNP配方，将混合条码文库的LNP注射到小鼠体内，并对从不同组织中提取的条码进行测序，来对应递送到该组织的LNP配方，目前已经能在小叔中将Cas9 mRNA和sgRNA递送至脾内皮细胞，且做到与递送至肝细胞相当的效率；另一种方法是选择性器官靶向（SORT）的LNP，通过额外添加带电脂质组分来调节纳米粒的内部电荷，而基本上不破坏LNP的标准组分，目前SORT LNP已经能将Cas9 mRNA和sgRNA递送至肺组织，基因编辑效率约15%，但这种调节LNP组分来赋予靶向能力的具体机制尚不明确。
还有一种实现非肝脏靶向的策略，是将靶向基团（如抗体片段）偶联到LNP表面，例如将CD5抗体-LNP偶联物静脉给药后可以靶向T细胞，瞬时转染产生治疗小鼠心脏损伤的CAR-T细胞，目前这种主动靶向策略尚未在人体中验证，但提供了LNP非肝脏靶向的潜力。
4.3 LNP递送的优势和未来展望
与病毒载体相比，LNP在递送基因编辑方面有几项优势：首先LNP递送可以实现瞬时表达，而不像病毒递送可能长时间表达，从而最大限度降低脱靶概率，也降低转染细胞被免疫系统供给从而影响细胞长期发挥作用的可能性；其次，LNP由于是合成的，其免疫原性远低于病毒，部分情况下可以支持重复给药；再次，目前使用的LNP组分在体内可分解且无毒，足以支持有效递送基因编辑的剂量，迄今为止都展现出很好的安全性特征；最后也是最重要的是，LNP的大规模生产工艺已经成熟，为使用LNP递送体内基因编辑药物的临床试验提供了基础。
开发非肝脏靶向的LNP载体仍是基因编辑领域的关键目标，了解不同的LNP配方和实现不同组织靶向性的机理，可能设计出更好靶向性的新LNP。目前HSC的基因编辑受到高度关注，LNP可以通过静脉或骨内注射，将基因编辑药物递送至骨髓造血干细胞，在无需采集、体外编辑、移植这一系列操作的情况下，彻底颠覆遗传性血液疾病的现有治疗模式。总的来说，考虑到近年来LNP在递送多种其他RNA药物取得的成功，LNP有望广泛地应用于肝脏和其他器官的体内基因编辑递送。
5. 病毒样颗粒载体
病毒样颗粒（VLP）由无感染性的病毒蛋白组成，除病毒遗传物质以外，还可以包裹递送mRNA、蛋白质或RNP等。VLP来源于现有的病毒支架，可利用病毒的天然特性实现有效的细胞内递送，具有封装药物、内涵体逃逸和被重编程来靶向不同细胞等功能。然而，与病毒载体不同，VLP亿mRNA和蛋白质而非DNA的形式，来进行基因编辑药物的瞬时递送，这显著降低了脱靶编辑和病毒基因组整合的风险。因此，VLP成为递送基因编辑药物很有吸引力的载体。
几乎所有报道的用于递送mRNA或蛋白药物的VLP都基于逆转录病毒，这种病毒具备作为VLP的几种理想特性：首先未成熟的逆转录病毒颗粒呈球形，通常缺乏刚性对称结构，与大多数无包膜的二十面体病毒载体相比，可以增加封装药物的灵活性；其次逆转录病毒直径较大（100-200 nm），提供了更大的装载空间；最后逆转录病毒可实现模块化设计，用包膜糖蛋白来控制细胞靶向性，用衣壳蛋白来控制药物封装，而各类衣壳结构可以轻松地与包膜糖蛋白组装结合。尽管逆转录病毒VLP作为mRNA和蛋白质的递送载体已经被探索了几十年，但近期首次实现了VLP介导基因编辑的有效递送。
5.1 VLP递送mRNA
VLP包装的mRNA通过独特的分子机制被特定的病毒衣壳蛋白识别，随后整合到病毒粒子中。逆转录病毒的RNA基因组包含一个包装信号（Ψ），这种信号可以引导病毒RNA封装到病毒粒子中，因此经工程改造含有Ψ的mRNA也将同样地整合到病毒粒子中。目前，首款使用Ψ将Cre重组酶mRNA整合到小鼠白血病病毒（MLV）颗粒中，重要的是该含有Ψ的mRNA经过额外修饰，使其不会被MLV逆转录酶作用，形成mRNA的瞬时递送，而不是将病毒cDNA稳定整合到转染细胞的基因组中。然而，每个病毒颗粒只能包装2个含有Ψ的RNA拷贝，还需要开发替代策略，使得VLP载体能包装更多mRNA。
为提升VLP的包装潜力，利用MS2衣壳蛋白（MS2cp）和MS2适配体（MS2apt）之间的相互作用，将mRNA直接包装进经过修饰的HIV-1病毒粒子中，用MS2cp替换HIV-1核衣壳蛋白的ZF2结构域，并在荧光素酶mRNA的3’端加入12个MS2apt拷贝，这使得每个VLP能够包装5-6个拷贝的荧光素酶mRNA。因此，在逆转录病毒衣壳蛋白中包含MS2cp、在mRNA中包含MS2apt，被认为是一种用VLP递送mRNA的潜在方法，已经有多个研究使用了这种MS2cp/MS2apt策略。
还有一种类似的将SpCas9的mRNA包装到HIV-1 VLP的系统mLP，将1个拷贝的MS2cp与HIV-1 gag-pol的N端融合，将6个拷贝的MS2apt加到SpCas9 mRNA的3' UTR。mLP在HEK293T、NIH3T3、K562和Jukat等细胞中都展现出较高的编辑效率，在小鼠单次视网膜下注射mLP成功介导RPE细胞中44%的VEGFa敲除，还成功使用装有SpCas9 mRNA和2个sgRNA的mLP通过同时靶向两种HSV基因来治愈小鼠的疱疹性角膜炎。
VLP包装递送Cas9 mRNA进行基因编辑的一大缺陷，是在sgRNA的递送上存在挑战，不经过化学修饰的gRNA会很快被降解，除非通过与Cas9蛋白络合而受到保护，因此在转染细胞中Cas9蛋白翻译合成前，VLP中的gRNA可能已经被大量降解了。尽管IDLV上编码的sgRNA能够通过Cas9 mRNA VLP进行有效编辑，但在转染细胞中仍以游离形势存在，如前所述尽管IDLV能够降低基因组整合的可能性、但仍然存在可被检测的整合，这使得此类方法存在一定风险。
5.2 VLP递送蛋白质或RNP
VLP包装蛋白质或RNP需要在VLP形成时，将目标蛋白定位在VLP中，为实现这一目的，可以将搭载物蛋白与病毒结构蛋白融合，包括在逆转录病毒gag多聚蛋白的不同位点，这可以在病毒衣壳自组装的过程中引导搭载物进入病毒粒子。多数情形下，gag和搭载物通过短肽序列相连，短肽在病毒成熟（搭载物被成功包装）后被一起封装的病毒蛋白酶切割，使得搭载物被释放到转染细胞中。
已有研究使用这种策略以VLP包装Cas9蛋白。例如，将SpCas9通过HIV-1蛋白酶的可切割接头与HIV-1 gag-pol的N端融合，用一起包装的慢病毒基因组表达sgRNA，这种结构在Jurkat细胞中实现14-28%的编辑效率；将SpCas9通过HIV-1蛋白酶可切割接头与HIV-1 gag的C端融合，用一起包装的慢病毒基因组或在VLP生产过程中用非慢病毒质粒来表达sgRNA，在Jurkat细胞中实现了高达90%的编辑效率、在原代人类T细胞中实现了高达70%的编辑效率，这比此前结果有了实质性的改善。
已有研究通过gag-Cas9的融合来用VLP包装RNP，被称为“纳米刀锋”，将SpCas9通过MLV蛋白酶可切割接头与MLV gag的C端融合，在VLP生产过程中用非病毒质粒来表达sgRNA，从而实现Cas9 RNP的包装。这种结构在HEK293T细胞中实现80-90%的编辑效率、在原代人类T细胞中实现30%的编辑效率、在原代人类HSPC中实现40%的编辑效率，且小鼠单次静脉注射纳米刀锋后在肝脏实现高达10%的编辑效率，首次验证VLP包装Cas9 RNP在体内基因编辑的有效性。
5.3 VLP递送的优势和未来展望
VLP递送基因编辑的主要优势在于，与质粒和病毒载体相比，VLP能最大程度降低脱靶风险。目前用VLP递送RNP已经能实现与VLP或LNP递送mRNA相当的编辑效率，而VLP-RNP递送的基因编辑药物暴露时间最短、因而脱靶风险较低，预计这有可能成为许多基因编辑应用的首选载体。VLP对不同细胞的靶向性可以通过改变包膜糖蛋白来调节，为了进一步提供VLP递送的应用范围，需要进一步证明VLP可以递送到其他器官，这样可以充分发挥VLP作为一种可编程靶向性的mRNA/RNP瞬时递送载体的潜能。VLP的大规模生产的可行性验证至关重要，如果能够扩大到更大规模临床前研究所需数量，则可以为VLP递送基因编辑在临床的应用铺平道路。
6. 未来前景和结论
人类体内基因编辑的时代已经到来，CRISPR-Cas技术的广泛开发和优化孕育了用于基因编辑的强大工具，包括Cas核酸酶、Base Editor和Prime Editor等，将这些工具与有效的体内递送方法（包括病毒载体、LNP、VLP等）相结合，已经在从动物模型到人体临床得到了不同程度的概念验证。
目前的递送方式已经可以让基因编辑元件，通过静脉注射递送至肝脏细胞、通过眼内注射递送至眼睛细胞，因而眼下可以用于人体的基因编辑药物最可能先出现在治疗肝脏和眼部疾病。静脉注射靶向肝脏以外器官的基因编辑递送仍然充满挑战：天然存在和人工设计的AAV衣壳，对靶向CNS、骨骼肌、心脏等器官有较大前景；通过使用不同的包膜糖蛋白，VLP也有希望能实现靶向不同的细胞；虽然通过调整LNP配方来实现靶向不同细胞的机制尚不明确，但将靶向元件与LNP表面偶联的策略被证明十分有效。
对于每一种体内基因编辑的应用，很重要的是了解是否需要做到组织特异性、以及是否需要靶向肝脏以外的器官，能靶向特定组织的特定细胞类型有可能带来独特的治疗优势。重要的是，体内基因编辑应仅针对体细胞，并且必须始终避免生殖细胞编辑，否则会带来严重的伦理问题。
与基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的对递送载体的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对Cas9或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。虽然在没有已存在免疫的情况下，单次给药是有效的，但这种给药本身可能触发适应性免疫应答，使得重复多次给药很难有效。这些问题凸显了一次性、瞬时和高效递送的载体的重要性，例如LNP和VLP。
与长时间表达的递送方式相比，瞬时递送的另一个优势就在于能够降低脱靶的概率，在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期发生时也可能导致致癌突变。病毒载体通常能够产生较长时间的表达，就需要开发在完成编辑后关闭表达的方法，来减少脱靶；mRNA递送是瞬时的，并且脱靶概率较低；RNP因其暴露时间较短，而降低脱靶概率，目前看RNP如能实现有效递送则可能有很大影响力。
随着体内基因编辑疗法迅速走向临床，稳健的体内递送方案显得至关重要，未来递送的不断演进也将助力更加广泛的体内基因编辑应用，以及其他大分子药物的出现
