快速且经济有效地检测多种核酸对于传染病的高效诊断至关重要。尽管可以使用各种核酸扩增方法以较低的成本检测多个靶标，但仍存在一些局限性和挑战。近年来，规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，简称CRISPR系统）常与等温核酸扩增策略结合以进一步提高检测灵敏度。由于重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）反应仅需单一温度，而且与CRISPR/Cas系

  摘要

  快速、廉价且能够进行多重核酸检测对人类健康具有重要意义，但这目前仍是一个重大挑战。本研究报道了一个将微流体设备与CRISPR-Cas12a和多重重组聚合酶扩增(RPA)耦合的独特的核酸检测平台的建立。该传感平台仅使用一个荧光探针，可以通过微流控空间编码同时检测多达30个核酸靶标，检测限可达0.26 aM，且多重检测仅耗时40分钟。随后，研究通过高效检测九价HPV疫苗靶向的9种HPV亚型，证明了建立的该研究平台的实用价值。在100例HPV感染风险患者样本的检测中显示出97.8%的灵敏度和98.1%的特异性。此外，研究通过成功测试8种最具临床相关性的呼吸道病毒，证明了建立的方法的适用性。

  实验设计原理：

  取样后，热解诱导宫颈癌细胞DNA的释放，在不经过提纯的情况下直接进行多重RPA同时扩增，选择扩增HPV其中的9个亚型。将扩增产物加载到设计的星型微流控芯片中心，扩增产物会平均分配流动到芯片四周的30个检测孔中。这30个检测孔每3个为一组，每组检测孔中都预先注入了靶向不同HPV亚型的crRNA、Cas12a和荧光信号分子混合物。每个检测孔中分别进行Cas12a切割反应，若扩增产物中存在能和crRNA完全匹配的序列，则该检测孔中的Cas12a被激活，切割荧光信号分子，该检测孔就能产生可检测的荧光信号。

  图1. 检测原理图

  实验结果

  1. RPA引物与crRNA的设计与验证

  研究首先在HPV不同亚型的L1基因上设计引物，扩增L1基因的某一片段(图2a)。用设计的引物进行单独RPA扩增，均能产生明显的扩增条带(图2b)。多重RPA扩增后经过测序分析证明9个亚型均能成功扩增(图2c)。之后优化了9个亚型HPV靶标各自对应的crRNA序列。图2d展示了以HPV-16为例的crRNA序列的选择。

  图2 RPA引物与crRNA的设计

  接着应用CRISPR/Cas12a系统来检测RPA获得的产物，设计了一个矩阵测试来验证crRNA的性能(图3a)。用不同的crRNA分别和9种亚型的HPV扩增产物反应，结果证明了每种crRNA只能靶向相应的HPV亚型，不会发生交叉反应(图3b)。之后用不同的crRNA与多重RPA扩增后的产物反应，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，证明了在9种HPV亚型都存在时，crRNA也能够成功靶向并激活Cas12a(图3c-d)。同时，根据后续基于芯片的实验中所使用的荧光读数，检查了4重和9重检测的剪切产物。结果与电泳结果一致，在4重和9重检测中分别观察到4个和9个明亮的荧光信号(图3e)。

  图3 crRNA和多重RPA性能的综合表征

  2. 多重RPA检测的灵敏度测试

  以不同浓度的HPV模板进行RPA扩增后检测荧光强度，结果表明，与空白组的背景荧光信号对比，基本上都可达到10-17~10-18 M的灵敏度。

  图4 9重RPA法对9种HPV亚型的灵敏度测试试验

  3 芯片性能测试

  将液体从芯片中心注入后，测量周围30个检测孔中的液体体积，证明了芯片可以将中心的液体均匀分配到每个检测孔中(图5a-b)。以HPV-16为例，每个检测孔中都预先加入靶向HPV-16的crRNA、Cas12a和荧光信号分子，将HPV-16的扩增产物从芯片中心注入，每个检测孔中的荧光强度基本相同，证明了芯片本身不会影响检测孔的荧光强度(图5d)。

  图5 芯片性能评估

  4. 实际样本检测

  该芯片读取方法与基于多色PCR的方法对临床样品的测检结果进行对比，结果高度一致(图6)。将所有9个亚型的阳性和阴性结果在100个样本池中进行汇总，可见其频率存在差异。总体而言，本研究建立的方法在测试这些患者样本时表现良好，阳性预测一致性为97.8%，阴性预测一致性为98.1%，灵敏度为97.8%，特异性为98.1%。

  图6 100个病人样本的HPV感染检测结果

  结论

  研究开发了一个多路核酸检测系统，通过利用多重RPA放大的出色性能，CRISPR/Cas12a系统在靶标识别方面的高特异性，以及微流体设备在液体处理方面的显著效用，使用简单的程序和较短的检测时间，建立的系统可以同时检测多个靶标。与临床报告相比，建立的该多重检测系统检测结果可靠、准确。